碱基编纂器（Base editor，BE）是一类在单碱基程度实现特定碱基类型高效精准编纂的东西，其极年夜地增进了根本研究、基因医治、动植物育种改进等范畴的进展。今朝普遍利用的DNA碱基编纂器首要是将可编程的DNA连系卵白（Cas9，Cas12或TALE卵白变体）与碱基脱氨酶（胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶变体）整合在一路实现的，首要有两种类型：ABE（Adenine base editor，腺嘌呤碱基编纂器）和CBE（Cytosine base editor，胞嘧啶碱基编纂器），别离可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的改变【1-2】。在此根本上，研究人员开辟出了多种可以实现特定功能的碱基编纂器。好比，在CBE的根本上开辟了能实现C-to-G改变的CGBE（C-to-G base editor）【3-6】。比来，杨辉团队在ABE的根本上开辟出了可以或许实现A-to-T和/或A-to-C这类碱基改变的新型DNA碱基编纂器AYBE（adenine transversion base editor）(NBT｜杨辉团队开辟出新型DNA碱基编纂器初次实现高效的腺嘌呤碱基颠换编纂)【7】云开体育app最新版本。 截止今朝，所有的碱基编纂器（包罗线粒体碱基编纂器，DdCBE【8-9】）都需要以A或C的脱氨基反映作为肇端步调，才能激发后续的DNA修复进程，进而实现方针碱基的编纂。固然非编纂链上的G或T在编纂链上的C或A被编纂的同时也会响应产生改变，但受限在PAM和编纂窗口等身分的影响，良多环境下仍需要对G或T进行直接的编纂。现有的脱氨酶不克不及将基因组DNA中的鸟苷（G）和胸苷（T）催化为其他核苷，是以对鸟苷（G）和胸苷（T）的进行直接编纂在基因编纂范畴存在手艺空白。 2023年5月16日，辉年夜（上海）生物科技有限公司杨辉团队（以下简称“辉年夜基因”）在National Science Review（NSR）上颁发了题为 Programmable deaminase-free base editors for G-to-Y conversion by engineered glycosylase 的研究论文。该研究综合操纵卵白质工程、流式细胞术、小鼠胚胎显微打针、深度测序等手艺手段，开辟出了不依靠任何脱氨酶的新型DNA碱基编纂器——基在工程化的糖基化酶的鸟嘌呤碱基编纂器（glycosylase-based guanine base editor, gGBE）。研究人员对gGBE进行了一系列的工程化革新、卵白质进化、突变挑选和验证，实现了高效的鸟嘌呤碱基编纂。值得一提的是，本研究提出了基在工程化的糖基化酶的一类碱基编纂器开辟的新策略，为进一步丰硕碱基编纂东西包、对根本研究范畴疾病模子的成立和基因医治范畴等都有着很是主要的意义。 今朝还没有一种碱基编纂器可以实现对G或T的直接编纂。因为G脱氨后很少能引发碱基的改变，而T贫乏氨基，使得开辟可以或许直接编纂G或T的碱基编纂器仍存在很年夜的挑战。除碱基脱氨基外，碱基丢掉（脱嘌呤/脱嘧啶）也是一种很是遍及的DNA毁伤情势。碱基切除修复（base excise repair，BER）可以有用修复因碱基脱氨基或碱基丢掉等发生的碱基毁伤，并且这一DNA毁伤修复路子在DNA碱基编纂器的开辟中已普遍利用。研究人员发现N-甲基嘌呤DNA糖基化酶（MPG；也称烷基腺嘌呤DNA糖基化酶，AAG）在体外尝试中有较低的切除正常的G的活性【10】，在是假想可以经由过程工程化革新MPG慢慢开辟出高效的gGBE，从而实现对G的直接编纂。 研究团队前期经由过程卵白质工程优化，取得了高效切除次黄嘌呤碱基（Hx）的MPG变体【7】，而Hx在布局上与G和A很是类似，研究人员起首着手检测分歧MPG变体切除G或A的环境。为了便在评估G或A切除事务的产生和响应的碱基编纂效力，研究人员设计了一套基在内含子剪接可激活的荧光陈述系统。在该荧光陈述系统中，只有产生了G或A的切除且实现了响应碱基的改变，才能改正内含子剪接旌旗灯号使剪接进程准确产生，进而激活绿色荧光卵白（EGFP）的正常表达，便以连系流式细胞术检测碱基编纂后发生的绿色荧光旌旗灯号。 图1：两类碱基编纂器比力和gGBE的卵白质工程化设计和优化挑选 研究人员将分歧版本的MPG变体融会在nCas9的C结尾，构建了多个不依靠脱氨酶的基在糖基化酶的碱基编纂器（deaminase-free glycosylase-based base editor, gBE）。操纵A-to-T陈述系统和G-to-T陈述系统评估后，研究人员发现带有MPGv0.2-MPGv3分歧变体的gBE都能检测到G-to-T的编纂活性，而没有检测到A-to-T的编纂活性。带有MPGv3的gBE具有最高的活性，而被定名为gGBEv3。为了晋升gGBE的编纂活性，研究人员连系卵白布局阐发，对gGBE中的MPG组分进行了理性设计，制订了多种工程化革新策略，构建了一系列突变体库，并操纵上述G-to-T陈述系统在哺乳动物细胞中展开了多轮的优化挑选，开辟出了鸟嘌呤编纂效力较高的gGBEv6.3。连系G-to-T陈述系统评估，gGBEv6.3的鸟嘌呤编纂活性（50.8%）是带有野生型MPG版本gGBEv0.1（0.03%）的跨越1694倍，取得了很是显著的优化进级（图1）。各个gGBE变体的鸟嘌呤编纂效力在两个內源位点上也获得了验证（鸟嘌呤的整体编纂效力别离从6.4%和7.5%提高到了78.5%和80.3%），并且表示出了较低的indels频率。 图2：gGBEv6.3在內源位点上的机能评估和相干利用 接着，研究人员在人类基因组内的24个靶点对gGBEv6.3作了综合评估，发现其可实现高达81.2%的鸟嘌呤编纂效力，产品首要是G-to-C和G-to-T的编纂，G-to-Y占比（Y = C or T）可达95%（图2）。经由过程对sgRNA依靠的和sgRNA非依靠的脱靶阐发，研究人员发现gGBEv6.3的DNA脱靶程度较低。本研究也探讨了gGBEv6.3在剪接位点编纂、提早终止暗码子（premature termination codons, PTCs）的引入等方面的利用潜力。研究人员发现gGBEv6.3可以有用编纂DMD基因第45号外显子的剪接管体位点（整体编纂效力达30.3%）。进一步的研究发现，gGBEv6.3在小鼠胚胎中表示出了高效的体内编纂活性（PTCs引入效力平均达50.9%，最高达89.9%），而且只发生很少的indels。跨越57%的F0代小鼠表示出白化或嵌合表型（图2）。 在所有人类致病性SNPs（共60372个）中，约有10%的C-to-G和5%的T-to-G SNPs。虽然CGBE可以改正C-to-G SNPs【6-10】，但因为PAM的限制和狭小的编纂窗口，我们凡是没法找到有用的sgRNA。与CGBE比拟，gGBE可以经由过程靶向相反的链来增添找到有用sgRNA的机遇。对T到G SNPs，今朝没有任何碱基编纂器可以有用地引诱G到T（或反义链中的C到A）转化。是以，gGBE极年夜地拓宽了根本编纂器的方针规模。 总的来讲，该研究缔造性地设计了一种不依靠任何脱氨酶的新型DNA碱基编纂器，经由过程卵白质工程优化开辟出了基在糖基化酶的鸟嘌呤碱基编纂器。这一工作不但弥补了今朝碱基编纂器不克不及直接编纂G的空白，并且提出了基在糖基化酶的一类新型碱基编纂器开辟的策略，为丰硕根本研究和基因医治范畴研究的碱基编纂东西包有着很是主要的意义。 辉年夜基因立异研究院童华威博士、刘纳纳博士、魏迎辉博士、周英思博士、李芸和吴丹妮为该论文的配合第一作者。辉年夜基因开创人&首席科学参谋杨辉博士、辉年夜基因立异研究院童华威博士为该论文的通信作者。 原文链接：https://academic.oup.com/nsr/advance-article/doi/10.1093/nsr/nwad143/7165770 参考文献 1. Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017). 2. Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016). 3. Kurt, I.C. et al. CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNA transversions in human cells. Nat Biotechnol 39, 41-46 (2021). 4. Zhao, D. et al. Glycosylase base editors enable C-to-A and C-to-G base changes. Nat Biotechnol 39, 35-40 (2021). 5. Koblan, L.W. et al. Efficient C*G-to-G*C base editors developed using CRISPRi screens, target-library analysis, and machine learning. Nat Biotechnol 39, 1414-1425 (2021). 6. Yuan, T. et al. Optimization of C-to-G base editors with sequence context preference predictable by machine learning methods. Nat Commun 12, 4902 (2021). 7. Tong H, Wang X, Liu Y, et al.; Programmable A-to-Y base editing by fusing an adenine base editor with an N-methylpurine DNA glycosylase. Nat Biotechnol 2023. doi: 10.1038/s41587-022-01595-6. 8. Mok BY, de Moraes MH, Zeng J, et al.; A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature 2020;583(7817):631-637. doi: 10.1038/s41586-020-2477-4. 9. Lei Z, Meng H, Liu L, et al.; Mitochondrial base editor induces substantial nuclear off-target mutations. Nature 2022;606(7915):804-811. doi: 10.1038/s41586-022-04836-5. 10. Berdal KG, Johansen RF, Seeberg E; Release of normal bases from intact DNA by a native DNA repair enzyme. EMBO J 1998;17(2):363-7. doi: 10.1093/emboj/17.2.363.

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